Urine metabolomic profiles of autism and autistic traits – a twin study

Datasetet består av två excel filer. En av dem (Full_Data_Arora...) innehåller data för 105 individer från studien beskriven nedan. Den andra filen (Data_Arora...) är en delmängd av datasetet som innehåller data för de 48 kompletta tvillingpar från studien. I denna studie valdes individer (N=105) och 48 kompletta tvillingpar från RATSS-kohorten, som är ett tvillingurval berikat med neuropsykiatriska funktionsnedsättningar (NPF) rekryterade från den allmänna svenska befolkningen mellan juni 2011 och december 2015, för icke-riktad masspektrometribaserad metabolomik av urinprover. Detaljerade inklusions- och exklusionskriterier för RATSS har tidigare publicerats. Bland de rekryterade tvillingarna valde vi deltagare för denna studie baserat på autismdiagnosstatus, om tvillingparet var konkordant (båda med autismdiagnos) eller diskordant (endast en med autismdiagnos) och om de hade tillgängliga urinprover. Dessutom matchade vi de icke-autistiska tvillingparen efter ålder och kön. Studien godkändes av den svenska Etikprövningsmyndigheten (2016/1452-31). Skriftligt informerat samtycke erhölls från alla deltagare eller deras vårdnadshavare, beroende på deras ålder. Under ett 2,5-dagars studiebesök genomförde ett team av kliniska experter en diagnostisk utvärdering av deltagarna i enlighet med riktlinjerna i Diagnostic and Statistical Manual of Mental Disorders, 5 (DSM-5). Utvärderingen använde en kombination av diagnostiska intervjuer, granskning av medicinska historiedokument och användning av etablerade diagnostiska verktyg. Detta inkluderade beteendebedömningsverktyg som Autism Diagnostic Interview-Revised (ADI-R) och Autism Diagnostic Observation Schedule 2nd Edition (ADOS-2). Dessutom användes ytterligare verktyg för att fastställa diagnoser av andra NPF, såsom Diagnostic Interview for ADHD in Adults (DIVA-2), Structured Clinical Interview for DSM-IV (SCID-IV) och Adaptive Behavior Assessment System (ABAS) – mer detaljerad information finns i publikationen av Bölte och kollegor (PMID: 24735654). Autistiska drag utvärderades med föräldrarapporterade versionen av Social Responsiveness Scale 2nd Edition (SRS-2), bestående av 65 punkter. Intelligenskvot (IQ) mättes med Wechsler Intelligence Scale for Children eller Adults - IV General Ability Index (GAI). Dessutom tillfrågades deltagarna om en lista över deras aktuella, regelbundet använda mediciner under studiebesöket. Eftersom det fanns en samling av olika mediciner inklusive antidepressiva och ADHD-mediciner, grupperades alla tillsammans och justerades för i våra analyser. Ingen undergruppering var möjlig för läkemedlen på grund av brist på kraft att upptäcka metabolomiska effekter av specifika läkemedel. Urin uppsamling och metabolomik: Urinproverna samlades in den sista dagen av besöket från studiedeltagarna. Först informerades deltagarna om urinprovsamlingen i en särskild urinbägare. Urinbägaren gavs sedan till en forskningssjuksköterska som överförde 10 ml av den insamlade urinen till ett sterilt vakuumrör utan tillsatser. Provet transporterades sedan direkt, delades upp och lagrades i Karolinska Institutets biobank vid -80 °C. De insamlade proverna transporterades vidare för analys till Proteomics and Metabolomics Facility, University of Tuscia, Italien. Alla prover hanterades enligt samma angivna protokoll. Före metabolomanalysen mättes urinens specifika gravitation efter centrifugering vid 13 000 g i 10 minuter. Urinalikvoter (200 μl) blandades med 200 μl metanol:acetonitril (50:30:20), vortexades i 30 minuter, vid maximal hastighet vid 4 °C och centrifugerades sedan vid 16 000 g i 15 minuter vid 4 °C. Supernatanten samlades in för metabolomanalys. Ultra-High Performance Liquid Chromatography (UHPLC) För experimenten injicerades 20 µL av proverna i ett UPLC-system (Ultimate 3000, Thermo Scientific) och analyserades i positivt läge: prover laddades på en Reprosil C18-kolonn (2,0 mm × 150 mm, 2,5 μm - Dr Maisch, Tyskland) för separation av metaboliter. Kromatografiska separationer uppnåddes vid en kolonntemperatur av 30 °C och ett flödeshastighet på 0,2 mL/min. En linjär gradient (0–100%) av lösningsmedel A (ddH2O, 0,1% myrsyra) till B (acetonitril, 0,1% myrsyra) användes över 20 minuter, återgår till 100% lösningsmedel A på 2 minuter och en 6-minuters eftertid med lösningsmedel A. Acetonitril, myrsyra och HPLC-klass vatten köptes från Sigma Aldrich. Högupplösande masspektrometri (HRMS) UPLC-systemet kopplades online med en masspektrometer, Q Exactive (Thermo Scientific), som skannade i full MS-läge (2 μ-skanningar) med en upplösning av 70 000 i intervallet 67 till 1000 m/z, mål på 1 × 106 joner och en maximal joninjektionstid (IT) på 35 ms, 3,8 kV sprutspänning, 40 skyddsgas och 25 hjälpgas, som användes i negativt och sedan positivt jonläge. Källjoniseringsparametrar var: sprutspänning, 3,8 kV; kapillär temperatur, 300 °C; och S-Lens nivå, 45. Kalibrering utfördes före varje analys mot positiva eller negativa jonlägeskalibreringsmixar (Piercenet, Thermo Fisher, Rockford, IL) för att säkerställa sub-ppm-fel av den intakta massan. Metabolitmätning: Data normaliserades efter urinens specifika gravitation eftersom kreatininutsöndring kan vara onormalt reducerad hos autistiska barn [31]. Replikat exporterades som mzXML-filer och bearbetades genom MAVEN [32]. Masspektrometrikromatogram utarbetades för toppjustering, matchning och jämförelse av föräldra- och fragmentjoner, och tentativ metabolitidentifiering (inom ett 10-ppm massavvikelseintervall mellan observerade och förväntade resultat mot den importerade Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) databasen).